Proteomics

nieobowiązkowe

w sali

Fakultet dotyczy technik używanych do prowadzania analiz proteomicznych. Studenci będą oczyszczać kompleksy białkowe i analizować ich skład za pomocą spektrometrii mas. Równolegle w części teoretycznej studenci będą poznawać zastosowanie metod protomicznych do różnych zagadnień w biologii i medycyny.

Studenci będą przeprowadzać oczyszczanie różnych kompleksów białkowych z drożdży Saccharomyces cerevisiae oraz Schizosaccharomyces pombe (każda para inny kompleks) przy użyciu metody Tandemowej Chromatografii Powinowactwa. Polega ona na wprowadzaniu za pomocą rekombinacji homologicznej znacznika TAP na końcu C badanego białka przy zachowaniu naturalnego promotora i oczyszczaniu kompleksu białkowego za pomocą dwóch następujących po sobie kroków chromatografii powinowactwa. Po oczyszczaniu część frakcji będzie trawiona trypsyną i bezpośrednio analizowana w spektrometrze mas. Pozostała część oczyszczonych kompleksów będzie wytrącana, rozdzielana na żelach białkowych typu SDS-PAGE i barwiona błękitem Coomassie. Prążki widoczne na żelach będą wycinane i zostanie przeprowadzona identyfikacja za pomocą trawienia trypsyną i spektrometrii mas. Studenci będą sami prowadzić preparatykę próbek, polegającą na redukcji/alkilacji cystein, trawieniu białek trypsyną i elucji powstałych peptydów z żelu. Dane uzyskane w analizach proteomicznych będą interpretowane przez studentów (6 godzin). Studenci zapoznają się z wtedy z oprogramowaniem niezbędnym do rozumienia danych uzyskiwanych w analizach proteomicznych (programy MASCOT, ProteinProspector).

Fragment białka A znajdujący się w znaczniku TAP pozwala również na bardzo łatwą detekcję białka fuzyjnego za pomocą analizy typu western, przy użyciu jako przeciwciała peroksydazy chrzanowej opłaszczonej przeciwciałami IgG królika. Studenci będą szacować wielkość analizowanych kompleksów za pomocą sączenia molekularnego, po którym frakcje będą analizowane techniką western.

Studenci na podstawie wyników spektrometrii mas, obrazu żelu i sączenia molekularnego powinny wysunąć hipotezy dotyczące składu oraz stechiometrii podjednostek analizowanych kompleksów.

Część teoretyczna - 15 godzin.

Wykład przedstawia podstawy teoretyczne analiz proteomicznych z zastosowaniem spektrometrii mas. Proteomika definiowana jest jako narzędzie systemowego podejścia do biologii umożliwiające identyfikację składu białkowego próbek, określanie i lokalizację ich modyfikacji potranslacyjnych i mapowanie sieci oddziaływań między białkami. Godziny1-3: ogólne informacje o proteomach, cechy białek ważne dla zrozumienia technik proteomicznych, oraz metody ekstrakcji, frakcjonowania i wzbogacania proteomów. Godziny 4-5: wprowadzenie do spektrometrii mas jako najbardziej efektywnej metody analitycznej. Omawiany jest sposób, w jaki pomiary mas cząsteczkowych prowadzą do identyfikacji białek, rodzaje spektrometrów mas i typy przeprowadzanych analiz. Godziny 6-8: objaśnienie i interpretacja widm uzyskiwanych w spektrometrii mas. Omawiane są widma mas cząsteczkowych dla peptydów i białek oraz metody obliczania mas cząsteczkowych. Podkreślona jest rola fragmentacji cząsteczek w trakcie pomiaru mas, jako narzędzia niezbędnego w nowoczesnej proteomice. Godziny 9-12: przedstawienie procesu identyfikacji białek przez pomiary mas fragmentów białek w eksperymencie sprzężenia chromatografii cieczowej i spektrometrii mas z fragmentacją kolizyjną (LC-MS-MS/MS), przeszukiwanie baz danych sekwencji białkowych i identyfikację białka przez porównanie z danymi eksperymentalnymi. Omawiane są stosowane narzędzia bioinformatyczne, porównywane różne strategie używane do identyfikacji oraz sposoby oceny i weryfikacji uzyskiwanych rezultatów. W dalszej części przedstawione są metody identyfikacji i lokalizacji modyfikacji potranslacyjnych. Ostatnią część wykładu zajmują przykłady zastosowań różnego typu eksperymentów proteomicznych do rozwiązywania problemów zarówno w biologii jak i w medycynie. Przedstawiane jest również nowe podejście do proteomiki różnicowej z zastosowaniem znakowania stabilnymi izotopami. Omówione zostają perspektywy zastosowania proteomiki do diagnostyki medycznej zilustrowane pierwszymi próbami opracowania nowych procedur diagnostycznych np. dla wczesnego wykrywania raka.

Gary Siuzdak (1996) Mass Spectrometry for Biotechnology, Academic Press (ISBN 0-12-647471-0) - brak polskiej pozycji dot. proteomiki.

E. de Hoffmann, J. Chatette, V. Stroobant (1994) Spectrométrie de masse; Masson Editeur, Paris; tłum. L. Konopski (1998) Spektrometria Mas; Wydawnictwa Naukowo-Techniczne (ISBN 83-204-2291-4).

Robert A. W. Johnstone, Malcolm E. Rosse (1996) Mass spectrometry for chemists and biochemists; Press Syndicate of the University of Cambridge; tłum. pod red. Krystyny Jurkowskiej (2001) Spektrometria mas; Wydawnictwo Naukowe PWN SA (ISBN 83-01-13605-7).

Końcowa ocena jest oparta na następujących składowych:

1. ocena aktywności na zajęciach.

2. prezentacja śródsemestralna o oczyszczanych białkach i postępach w doświadczeniu.

3. raport i prezentacja na zakończenie zajęć.

Warunki przjęcia na zajęcia

Przyjmowani będą studenci pierwszego roku studiów magisterskich.

Informację o ocenie/ocenach i/lub preferencjach grup zajęciowych należy wpisać do załączonego formularza: https://docs.google.com/forms/d/e/1FAIpQLSckt9Hau6mM9xY81k5TZCHFISFDtTM-EeWrmR0oB2VdpjMTIQ/viewform?usp=sharing