Molekularne techniki analizy RNA -W

biologia
biotechnologia

monograficzne
nieobowiązkowe

Genetyka molekularna 1400-215GEBM
Genetyka z inżynierią genetyczną 1400-114GEN

Student powinien posiadać podstawową wiedzę z zakresu biologii molekularnej, co najmniej w zakresie realizowanym w ramach przedmiotu "Genetyka z inżynieria genetyczną" (kod przedmiotu 1400-114GEN; lub podobny). Dobrze, ale nie jest to warunek konieczny, gdy student wcześniej uczestniczył w fakultecie dotyczącym technik molekularnych, np. "Genetyka molekularna" (kod przedmiotu 1400-215GEBM; lub podobny).

Mile widziana ciekawość "Świata RNA".

w sali

Przedmiot jest skierowany do wszystkich studentów, zainteresowanych metabolizmem RNA oraz nowoczesnymi, molekularnymi technikami wykorzystywanymi w badaniu RNA.

Wykłady:

1. „Świat RNA” cz. 1.

Koncepcja „RNA world”. Nagrody Nobla w dziedzinie RNA. Katalityczne cząsteczki RNA – klasy, mechanizm, występowanie. SELEX. Pozostałości świata RNA - rybosom, splajsosom, wirusy RNA. Różnorodność klas RNA u Eukaryota i ich metabolizm. Podstawowe mechanizmy regulacji ekspresji genów od transkrypcji do translacji. Procesy alternatywne. Mechanizmy kontroli jakości RNA. Struktury rybonukleoproteinowe, kondensaty komórkowe.

2. „Świat RNA” cz. 2.

3. „Przegląd technik opartych o odwrotną transkrypcję. Techniki badania transkrypcji: TRO, ChIP, RIP i DIP. Analiza końców poliA RNA”.

Teoria odwrotnej transkrypcji (RT). Przegląd technik opartych o RT: RT-PCR w tym półilościowy, pulsacyjny RT-PCR, RACE, cRT-PCR, technika wydłużania startera ("primer extension"). Techniki badania nowopowstajacych transkryptów: jądrowy „Transcription Run-On“, immunoprecypitacja chromatyny (ChIP), immunoprecypitacja RNA (RiP). Do zilustrowania powyższych techniki posłużą badania terminacji transkrypcji Polimerazy I RNA. Specyficzność wiązania DNA przez czynniki transkrypcyjne: „ChIP on chip“, immunoprecypitacja DNA (DIP). Badanie końców poliA RNA (technika PASE, izolacja frakcji RNA poliA+).

4. „Niekodujące RNA”.

Niekodujące RNA (ang. non-coding RNA; ncRNA). Biogeneza i funkcje małych i długich niekodujących RNA. Mechanizmy wyciszania transkrypcji zależne od niekodujących RNA. Kompleksy RNP biorące udział w wyciszaniu transkrypcji. Rola chromatyny w regulacji ekspresji genów.

5. „Świat RNA” cz. 3.

6. „PCR w czasie rzeczywistym (ilościowy; qPCR)”.

Teoria qPCR: sposoby detekcji DNA, podstawy projektowania starterów, sondy hybrydyzacyjne, wprowadzenie do obliczeń. Zastosowania: określanie poziomu badanych transkryptów w komórce, wykrywanie kwasów nukleinowych patogenów, detekcja pojedynczych mutacji (SNP). Dobra praktyka laboratoryjna przy doświadczeniach qPCR i najczęstsze „pułapki czekające” na eksperymentatorów.

7. „RNA w neuronach“.

Transport mRNA do wypustek komórek nerwowych i lokalna translacja w odpowiedzi na pobudzenie synaptyczne. Metody wizualizacji mRNA z żywym neuronie w czasie rzeczywistym, hybrydyzacja in situ, metody biochemiczne pozwalające na bezpośrednią detekcję transkryptów ulegających lokalnej translacji w neuronach.

8. „Udział metabolizmu RNA w procesach fizjologicznych”.

Czynniki metabolizmu RNA i miRNA u roślin – rola w przekazywaniu sygnałów hormonalnych, rozwoju embrionalnym i generatywnym, zegarze dobowym, odporności na stres i patogeny.

9. „Badanie enzymów metabolizmu RNA na przykładzie egzosomu”.

Ścieżki rozkładu RNA w organizmach eukariotycznych. Egzo- i endo- nukleazy. Egzosom: wielofunkcyjny i wieloskładnikowy kompleks. Badania strukturalne i funkcjonalne egzosomu u drożdży i w komórkach ludzkich. Mechanizm działania, współpraca aktywności egzo- i endo-nukleolitycznej.

10. „Struktura RNA a funkcja. Mapowanie struktury RNA in vitro. Metody badania transkryptomów”.

Mapowanie struktury RNA in vitro: sondy molekularne trawiące specyficznie względem struktury i sekwencji RNA. Przełączniki RNA i aptamery – naturalne oraz wyselekcjonowane na potrzeby leków lub biosensorów. Wysokoprzepustowe metody badania transkryptomów oparte o techniki sekwencjonowania nowej generacji (RNA-seq, ChIP-seq).

11. „Metody badań strukturalnych RNA”.

Metody badania struktur kompleksów RNA-białko, metody krystalizacji kompleksów RNP (na przykładzie rybosomu, snRNP, RNazy H). Porównanie krystalografii i badań NMR dla RNA. Technika SAXS. Chemiczne (SHAPE) i bioinformatyczne przewidywanie struktur RNA. Technika mikroskopii elektronowej w niskich temperaturach (Cryo-EM).

12. „Globalne analizy kompleksów rybonukleoproteinowych“ cz. 1.

Metody biochemiczne czyszczenia kompleksów rybonukleoproteinowych (RNP). Chromatografia RNA i metody wysokoprzepustowe kompleksów RNP połączone z sekwencjonowaniem RNA NGS i spektrometrią mas. Analizy transkryptomu, translatomu i proteomu. Wysokoprzepustowe badania chromatyny, struktury RNA i oddziaływań RNA-RNA, RNA-DNA i RNA-białko. Metody wizualizacji pojedynczych cząsteczek RNA, transkrypcji i translacji w żywych komórkach. Analiza kompleksów RNP w komórkach metodami znakowania zbliżeniowego.

13. „Globalne analizy kompleksów rybonukleoproteinowych“ cz. 2.

Część wykładów będzie prowadzona przez zaproszonych gości.

Podręczniki „Genomy” T. Brown, „Genetyka molekularna” red. P. Węgleński, „Podstawy biologii molekularnej” L. A. Allison; literatura uzupełniająca: publikacje naukowe (doświadczalne i przeglądowe) wskazane w trakcie zajęć przez prowadzących; „Molecular Cloning: A Laboratory Manual” J. Sambrook i D. Russel 3-cia edycja lub 4-ta edycja M. R. Green and J. Sambrook.

Ma wiedzę na temat metabolizmu RNA u Eukariota.

Zna etapy ekspresji różnych klas RNA, ze szczególnym naciskiem na procesy współ- i po-transkrypcyjne, potrafi podać przykłady oddziaływań RNA - białko oraz zaangażowania cząsteczek RNA w procesy fizjologiczne.

Ma wiedzę dotyczącą enzymów modyfikujących RNA.

Posiada wiedzę teoretyczną i praktyczną pozwalającą na interpretowanie zjawisk i procesów związanych z metabolizmem RNA w oparciu o wyniki doświadczalne.

Samodzielnie planuje i przeprowadza podstawowe typy doświadczeń.

Zna słownictwo dot. metabolizmu RNA zarówno w jęz. polskim jak i angielskim, potrafi komunikować się i podejmować dyskusję na tematy związane z metabolizmem RNA.

Zna teoretyczne podstawy technik molekularnych wykorzystywanych do badania RNA, w stopniu pozwalającym na zrozumienie publikacji naukowych z tej dziedziny.

Potrafi krytycznie analizować otrzymane dane i je rzetelnie prezentować, co przyczynia się do podtrzymywania etosu zawodowego i rozwija zasady etyki zawodowej.

Językowe efekty uczenia się:

Wykorzystuje w sposób biegły naukowe i popularnonaukowe teksty biologiczne w języku ojczystym i angielskim oraz komunikuje się w języku angielskim na poziomie B2+ (K_U03 Bi2).

Posiada umiejętność przygotowania i wygłoszenia wystąpień ustnych w języku polskim i angielskim, zgodnie z wymaganiami określonymi dla poziomu B2+ (K_U11 Bi2).

Wykazuje umiejętność posługiwania się językiem nowożytnym (angielskim) w stopniu umożliwiającym korzystanie z literatury naukowej i komunikację z cudzoziemcami (K_U02 Bt2).

Warunki egzaminu końcowego z przedmiotu:

- przedmiot zaliczany jest na ocenę,

- egzamin testowy: test jednokrotnego wyboru (4 warianty odpowiedzi na każde pytanie),

- aby zaliczyć egzamin student musi uzyskać nie mniej niż 50% punktów.

Nie są wymagane.