Ruchome elementy genetyczne bakterii

fakultatywne

Znajomość podstawowych zagadnień związanych z mikrobiologią i genetyką.

w sali

Na zajęciach poruszane są następujące zagadnienia: I. Modularna struktura ruchomych elementów genetycznych. II. Integrony i superintegrony. III. Elementy transpozycyjne - ogólna charakterystyka sekwencji insercyjnych i transpozonów (TE). Metody identyfikacji funkcjonalnych TE z zastosowaniem wektorów pułapkowych. IV. Elementy integrujące z DNA i koniugacyjne. V. Plazmidy bakteryjne. (1) Identyfikacja plazmidów. (2). Schemat podstawowej charakterystyki plazmidów. (3) Replikacja plazmidów - modele replikacji plazmidów kolistych i liniowych. (4) Mechanizmy zapewniające stabilne utrzymywanie plazmidów w komórkach. (5) Systemy transferu plazmidów. VI. Mobilne introny i inteiny. VII. Funkcje fenotypowe bakterii kodowane przez MGE. VIII. Pochodzenie i ewolucja MGE. IX. Rola MGE w horyzontalnym transferze genów. X. Zastosowanie MGE w inżynierii genetycznej i biotechnologii. Na ćwiczeniach studenci zapoznają się z technikami wykorzystywanymi do molekularnej analizy MGE.

Opis wykładu:

Modularna struktura ruchomych elementów genetycznych (MGE, ang. mobile genetic element). Genomika bakterii. Rola MGE w kształtowaniu struktury genomów bakterii. II. Integrony i superintegrony (struktura genetyczna, klasyfikacja, rola w determinowaniu oporności na antybiotyki). III. Elementy transpozycyjne (TE, ang. transposable element) - ogólna charakterystyka sekwencji inercyjnych, transpozonów i nieautonomicznych elementów tarnspozycyjnych (MITE, ang. miniature inverted repeats transposable elements) (klasyfikacja, rozpowszechnienie w genomach bakterii, rodzaje zmian spowodowanych transpozycją, regulacja częstości transpozycji, rola w horyzontalnym transferze genów (HGT, ang. horizontal gene transfer). Metody identyfikacji funkcjonalnych TE z zastosowaniem różnego typu wektorów pułapkowych. IV. Elementy integrujące z DNA i koniugacyjne (ICE, ang. conjugative and integrative elements; IME, mobilizable integrative elements). V. Plazmidy bakteryjne (odkrycie, definicja, występowanie, nazewnictwo, klasyfikacja, struktura). (1) Identyfikacja plazmidów (metody genetyczne i fizyko-chemiczne). (2). Schemat podstawowej charakterystyki plazmidów (struktura, oznaczanie wielkości, liczby kopii, zakresu gospodarzy, grupy niezgodności, mapowanie restrykcyjne). (3) Replikacja plazmidów [modele replikacji plazmidów kolistych i liniowych, pojęcia: replikon, podstawowy replikon/minimalny replikon; origin replikacji (oriV), mechanizmy regulacji inicjacji replikacji, molekularne podstawy niezgodności (inc), plazmidów]. (4) Mechanizmy zapewniające stabilne utrzymywanie plazmidów w komórkach bakteryjnych (systemy: aktywnego rozdziału, rozdziału form oligomerycznych, addykcyjne - molekularne podstawy funkcjonowania; pochodzenie). (5) Systemy transferu plazmidów (plazmidy koniugacyjne i mobilizowalne; struktura oriT (ang. origin of conjugational transfer). VI. Funkcje fenotypowe bakterii kodowane przez MGE. VII. Mobilne itrony i interny. VIII. Pochodzenie i ewolucja MGE. IX. Rola MGE w horyzontalnym transferze genów. X. Zastosowanie MGE w inżynierii genetycznej i biotechnologii.

Opis ćwiczeń

Ćwiczenia mają charakter pracy laboratoryjnej w zespołach lub samodzielnie i są powiązane z zagadnieniami omawianymi na wykładach.

Podstawowe etapy identyfikacji i analizy plazmidów bakteryjnych: (1) Oczyszczanie plazmidowego DNA przez ultrawirowanie w gradiencie CsCl+EtBr; inne metody izolacji plazmidów; wizualizacja DNA megaplazmidów. (2) Konstrukcja minireplikonów (określenie replikonów minimalnych i podstawowych); wykorzystanie wektorów wahadłowych do analizy plazmidowych systemów replikacyjnych i systemów stabilizujących. (3) Wykorzystanie plazmidów bakteryjnych w inżynierii genetycznej: (a) rodzaje wektorów; (b) izolacja fragmentów restrykcyjnych plazmidowego DNA z żelu agarozowego; (c) klonowanie genów bakteryjnych w wybranych wektorach (różne rodzaje selekcji zrekombinowanych klonów). (4) Metody wprowadzania plazmidowego DNA do komórek bakterii: transformacja chemiczna, elektroporacja, koniugacja trójrodzicielska (wpływ zakresu gospodarzy, niezgodności plazmidów oraz bariery restrykcyjnej na utrzymywanie się plazmidów w różnych gospodarzach). II. Analiza systemów stabilizujących, kodujących toksynę i antytoksynę, pochodzących z różnego typu ruchomych elementów genetycznych (plazmid, bakteriofag, transpozon koniugacyjny): (1) Analiza organizacji genetycznej systemów addykcyjnych - izolacja i elektorforeza RNA oraz RT-PCR (ang. reverse transcription PCR). (2) Oznaczanie aktywności promotorów systemów addykcyjnych poprzez badanie aktywności enzymatycznej ß-galaktozydazy. (3) Konstrukcja i wykorzystanie bakteryjnych układów dwuhybrydowych do badania interakcji białek kodowanych przez systemy addykcyjne. (4) Wykorzystanie wektorów ekspresyjnych do analizy funkcjonalnej systemów addykcyjnych, badanie efektu toksycznego wywołanego przez trucizny różnych systemów addykcyjnych oraz zdolności antidotum do jego odwracania. III. Identyfikacja i analiza elementów transpozycyjnych (TE): (1) Identyfikacja TE z wykorzystaniem wektorów pułapkowych. (2) Określenie liczby kopii oraz lokalizacji zidentyfikowanych TE w genomie gospodarza poprzez hybrydyzację DNA-DNA. (3) Badanie rozpowszechnienia zidentyfikowanych TE poprzez analizę hybrydyzacyjną DNA-DNA z wykorzystaniem transferu typu DOT-BLOT. VI. Bioinformatyczne metody analizy sekwencji nukleotydowych ruchomych elementów genetycznych (programy: Artemis, BLAST, CloneManager, ORF Finder).

1. Biologia Molekularna Bakterii. Baj J., Markiewicz Z. (red.) PWN, 2015

2. Plasmid Biology. Funnel B.E., Philips G.J. (red.) 2003

3. The Horizontal Gene Pool: Bacterial Plasmids and Gene Spread. Thomas C.M. (red.). 2000

4. Mobile DNA III. Craig N.L., Chandler M., Gellert M., Lambowitz A.M., Rice P.A., Sandmeyer S.B. (red.) 2015

5. Bacterial Integrative Mobile Genetic Elements. Roberts A.P. and Mullany P. (red.) 2013

6. Mikrobiologia. Baj J. (red.) PWN, 2018

Po opanowaniu materiału objętego wykładem i ćwiczeniami student:

WIEDZA

- Wykazuje znajomość aktualnego stanu wiedzy w głównych działach genetyki bakterii, w tym terminologii przyrodniczej w zakresie mikrobiologii, genetyki i genomiki (w j. polskim i j. angielskim), najnowszych badań, odkryć i zastosowań ruchomych elementów genetycznych w biotechnologii, medycynie czy biologii molekularnej.

- Wykazuje znajomość zasad planowania badań, nowoczesnych technik zbierania danych oraz stosowania różnych narzędzi badawczych, w tym szerokiej gamy wektorów plazmidowych.

- Ma wiedzę dotyczącą: (i) samodzielnego planowania i prowadzenia prac doświadczalnych z zakresu analiz genetycznych mikroorganizmów, (ii) opracowywania wyników własnych badań w formie nadającej się do dyskusji, oceny lub publikacji oraz (iii) znaczenia pracy doświadczalnej w genetyce bakterii.

- Ma wiedzę na temat komórkowych i molekularnych podstaw funkcjonowania mikroorganizmów w świetle badań nad ruchomymi elementami genetycznymi bakterii.

UMIEJĘTNOŚCI

- Wykorzystuje zaawansowane techniki badawcze właściwe dla szeroko pojętej genetyki molekularnej i umożliwiające selekcję i ukierunkowaną modyfikację mikroorganizmów i ruchomych elementów genetycznych.

- Wykazuje umiejętność posługiwania się językiem nowożytnym (j. polski lub j. angielski) w stopniu umożliwiającym korzystanie ze źródeł elektronicznych i literatury naukowej poświęconej szeroko pojętej genetyce bakterii.

- Wykazuje umiejętność poprawnego wnioskowania i interpretowania wyników badań molekularnych na podstawie otrzymanych danych.

- Samodzielnie planuje proste eksperymenty z wykorzystaniem ruchomych elementów genetycznych bakterii (klonowanie, mutagenizację, etc.).

- Uczy się samodzielnie w sposób ukierunkowany.

KOMPETENCJE SPOŁECZNE

- Dostrzega wagę narzędzi statystycznych i bioinformatycznych przy opisie wyników prac eksperymentalnych i procesów zachodzących w przyrodzie.

- Wykazuje odpowiedzialność za powierzony zakres prac badawczych oraz za pracę laboratoryjną własną i innych.

- Wykazuje ostrożność i krytycyzm podczas zdobywania i interpretowania wiedzy z zakresu genetyki mikroorganizmów i jej zastosowania praktycznego.

- Wykazuje odpowiedzialność za ocenę zagrożeń wynikających ze stosowanych technik badawczych i tworzenie warunków bezpiecznej pracy.

- Rozumie potrzebę przekazywania informacji o nowych osiągnięciach biologii mikroorganizmów oraz ruchomych elementów genetycznych, a także potrafi przekazać te informacje w sposób zrozumiały.

Ocena końcowa jest oceną z egzaminu. Warunkiem dopuszczenia do egzaminu jest zaliczenie ćwiczeń na ocenę pozytywną.

Zajęcia laboratoryjne (ćwiczenia) są zaliczane jeśli student:

1) uczestniczył w co najmniej 85 procentach zajęć;

2) pracował na zajęciach w sposób pozwalający pozytywnie ocenić wiedzę, umiejętności i kompetencje społeczne, jakie w toku zajęć uzyskał (opisane w sylabusie jako przedmiotowe efekty kształcenia).

Szczegółowe warunki zaliczenia zajęć:

- aktywność na zajęciach;

- zaliczenie kolokwium opisowego (tj. uzyskanie co najmniej 51% punktów).

Oceną końcową z przedmiotu jest ocena z egzaminu. Warunki zaliczenia egzaminu (przedmiotu):

1) Warunkiem dopuszczającym do egzaminu jest zaliczenie ćwiczeń składających się na dany przedmiot.

2) Zaliczenie egzaminu złożonego z pytań testowych wielokrotnego wyboru z punktami ujemnymi (20 pytań) i pytań wymagających krótkich odpowiedzi opisowych (10 pytań). Próg zaliczenia - 51% punktów.

Nie.