Genetyka molekularna

biologia
biotechnologia

fakultatywne

Genetyka z inżynierią genetyczną 1400-114GEN

Genetyka z inżynierią genetyczną 1400-114GEN

Student powinien posiadać umiejętność:

1. posługiwania się pipetami automatycznymi;

2. pracy w warunkach jałowych i semijałowych;

3. rozdziału DNA przez elektroforezę w żelach agarozowych;

4. doboru wektorów odpowiednich dla zamiaru badawczego, w szczególności klonowania DNA;

5. rozróżnienia kwasów nukleinowych z uwagi na ich specyficzne właściwości fizyko-chemiczne;

6. określenia techniki PCR odpowiedniej dla zamierzonego celu badawczego;

7. zastosowania wiedzy zdobytej w trakcie realizacji przedmiotu 1400-114GEN.

w sali

Ćwiczenia praktyczne ze wstępem teoretycznym dotyczącym stosowanych metod molekularnych.

I. Zagadnienia z komputerowej analizy kwasów nukleinowych.

II. Technika PCR i analiza wybranych sekwencji DNA.

III. Konstrukcja kasety do ekspresji ludzkiego białka w komórkach E. coli (system pET). Zajęcia obejmują techniki inżynierii genetycznej takie jak: PCR, elektroforeza fragmentów DNA, klonowanie produktu PCR, elektroporacja i transformacja bakterii chemokompetentnych, izolacja plazmidowego DNA, mapy restrykcyjne, sekwencjonowanie DNA, ukierunkowana mutageneza.

IV. Konstrukcja szczepów drożdży zawierających w genomach sekwencje kodujące wybrane białka jako fuzje ze znacznikiem TAP: uzyskanie kasety do rekombinacji in vivo (PCR), transformacja drożdży, analiza transformantów (PCR, analiza western).

V. Analiza RNA z mutantów drożdży związanych z dojrzewaniem RNA: izolacja RNA, rozdział RNA w żelach, znakowanie kwasów nukleinowych, technika northern.

IV. RT-PCR, ilościowy PCR.

1. Wybrane metody komputerowej analizy DNA.

Omówienie najczęściej wykorzystywanych w biologii molekularnej baz danych, metod przeszukiwania za pomocą słów kluczowych i przez porównywanie sekwencji, podstawy porównywania sekwencji i tworzenia przyrównań lokalnych i globalnych. Wyszukiwanie informacji i sekwencji w bazach danych, analiza wyników sekwencjonowania, posługiwanie się serwerem BLAST, program Clustal.

Blok I: Otrzymywanie konstruktu dla ekspresji białka w układzie heterologicznym.

2. Omówienie doświadczenia, komputerowe metody projektowania doświadczeń w biologii molekularnej. Projektowanie klonowania w programie Serial Cloner, przewidywanie wyników analizy restrykcyjnej konstruktu.

3. Omówienie wektorów do ekspresji w układach heterologicznych. Klonowanie DNA: PCR, elektroforeza produktu PCR i jego trawienie endonukleazą restrykcyjną. Ligacja DNA.

4. Metody transformacji E. coli. Analiza ligacji i transformacja bakterii + przygotowanie bakterii chemokompetentnych (BL21).

5. Analiza transformantów: mikrolizaty + elektroforeza.

6. Sekwencjonowanie DNA. Endonukleazy restrykcyjne i inne enzymy stosowane w klonowaniu i analizie DNA. Mapy restrykcyjne. Analiza transformantów (analiza restrykcyjna mikrolizatów). Omówienie wyników transformacji. Analiza restrykcyjna konstruktów, mapy restrykcyjne, podsumowanie wyników klonowania.

Blok II: Otrzymywanie białek chimerowych w drożdżach - rekombinacja in vivo.

7. Oczyszczanie białek przez tandemową chromatografię powinowactwa (TAP). Sposoby konstruowania szczepów drożdży zawierających w genomach sekwencje kodujące wybrane białka ze znacznikiem do TAP.

Uzyskanie przez PCR kasety do rekombinacji in vivo. Transformacja drożdży.

8. Analiza transformantów, genotypowanie.

9. Technika western.

Blok III: Analiza RNA.

10. Izolacja RNA, elektroforeza RNA, technika northern. Analiza RNA z mutantów drożdży związanych z dojrzewaniem RNA.

11. Sondy molekularne, znakowanie kwasów nukleinowych.

12. RT-PCR - teoria odwrotnej transkrypcji (warianty metody, enzymy). Przeprowadzenie reakcji odwrotnej transkrypcji.

13. Real time PCR (RT-qPCR). Teoretyczne podstawy RT-qPCR, sposoby analizy wyników RT-qPCR.

Analiza produktów RT-PCR w żelu i omówienie wyników.

Skrypt do fakultetu "Biologia molekularna";

T. Brown "Genomy";

Lizabeth A. Allison "Podstawy biologii molekularnej".

1. Wybiera i stosuje techniki i narzędzia badawcze odpowiednie dla analizy organizacji i ekspresji informacji genetycznej

2. Wybiera i stosuje techniki odpowiednie dla otrzymywania konstruktów dla wytwarzania białek w układach heterologicznych

3. Potrafi pod nadzorem opiekuna planować eksperymenty z zakresu biologii molekularnej, w szczególności otrzymywanie konstruktów DNA dla ekspresji białek w E. coli

4. Potrafi posługiwać się podstawowymi metodami analizy kwasów nukleinowych in silico

5. Potrafi projektować eksperymenty wykorzystujące metody PCR, qPCR i RT-PCR do analizy kwasów nukleinowych

6. Potrafi otrzymać konstrukt DNA dla ekspresji białek w układach heterologicznych

7. Potrafi otrzymać kompetentne bakterie E.coli i wprowadzić do nich uzyskane konstrukty DNA

8. Potrafi opracować i krytycznie przeanalizować wyniki amplifikacji i klonowania fragmentów DNA

9. Potrafi konstruować szczepy drożdży zawierające w genomach sekwencje kodujące wybrane białka jako fuzje ze znacznikiem TAP oraz zweryfikować ich poprawność oraz funkcjonalność

10. Potrafi wykonać analizę RNA z drożdży, w szczególności ze szczepów z mutacjami zaburzającymi dojrzewanie RNA

11. Potrafi zaprojektować i wykonać reakcje RT-PCR

12. Potrafi pracować w 2-3 osobowym zespole

13. Wykazuje inicjatywę i samodzielność w czasie projektowania i wykonywania eksperymentów oraz potrafi samodzielnie myśleć analizując uzyskane wyniki

14. Wykazuje odpowiedzialność za realizowany projekt badawczy [K_K03]

15. Dostrzega konieczność stosowania zaawansowanych metod analizy wyników

16. Zna zaawansowane techniki analizy organizacji kwasów nukleinowych i ekspresji informacji genetycznej

17. Zna zasady planowania prostych eksperymentów z zakresu biologii molekularnej

18. Zna zasady BHP w laboratorium, w tym dotyczące pracy z materiałem promieniotwórczym

Symbole efektów uczenia się dla kierunku biologia, studia I stopnia:

K_W01, K_W02, K_W03, K_W10, K_W12, K_W14, K_W17, K_W19, K_U01, K_U03, K_U04, K_U05, K_U08, K_U09, K_K01, K_K03, K_K04, K_K05, K_K07

Symbole efektów uczenia się dla kierunku biotechnologia, studia I stopnia:

K_W01, K_W04, K_W08, K_W09, K_W11, K_U01, K_U03, K_U04, K_U05, K_U06, K_K01, K_K02, K_K03, K_K04

Podstawą zaliczenia jest ocena zdobytych przez studenta umiejętności planowania i krytycznej analizy uzyskanych wyników eksperymentów dokonana na podstawie:

1. egzaminu zaliczeniowego; warunkiem przystąpienia do egzaminu jest zaliczenie sprawdzianów z bloku I i II ćwiczeń.

3. udziału w zajęciach, zgodnie z regulaminem studiów UW

1400-114GEN, lub jego odpowiednika w przypadku studentów, którzy zajęcia z genetyki odbyli na innych uczelniach.