Molecular techniques of RNA analysis

biologia
biotechnologia

fakultatywne
nieobowiązkowe

Przedmiot jest skierowany do studentów wszystkich kierunków Wydziału Biologii UW oraz MISMaP, zainteresowanych metabolizmem RNA oraz nowoczesnymi, molekularnymi technikami wykorzystywanymi w badaniu RNA.

1. Podstawy pracy z RNA. Izolacja RNA z drożdży i z roślin.

2. Ocena jakości RNA. Rozdział w żelach. Radioizotopowe i fluorescencyjne metody detekcji RNA. Detekcja miRNA u roślin - wprowadzenie. Detekcja miRNA u roślin, technika Northern-blot (1) z rozdziałem RNA w żelu poliakrylamidowym.

3. Technika Northern-blot (1): hybrydyzacja z sondą oligonukleotydową znakowaną biotyną. Płukania, skan i analiza wyników. Wykrywanie transkryptów CUT u drożdży: technika Northern-blot (2) z rozdziałem RNA w żelu agarozowym.

4. Detekcja CUT u drożdży: znakowanie sondy metodą "asymetryczny PCR" i hybrydyzacja. Analiza obrazu w nauce.

5. Detekcja CUT u drożdży: omówienie wyników hybrydyzacji Northern-blot (2). Analiza końców 3' małych jąderkowych RNA (snoRNA) przy pomocy cRT-PCR. Cięcie Rnazą H dupleksów RNA-oligonukleotyd i ligacja (cyrkularyzacja) RNA.

6. Analiza końców 3' snoRNA: RT + PCR.

7. cRT-PCR: rozdział produktów w żelu i omówienie ich sekwencjonowania. Wykrywanie mRNA metodą RT-qPCR. Projektowanie starterów do qPCR - teoria i praktyka. Konkurs na najwydajniejszą parę starterów, tzn. każdy student zaprojektuje przynajmniej 1 parę starterów, która zostanie zamówiona i przetestowana na następnych zajęciach.

8. Przeprowadzenie reakcji qPCR: testowanie zaprojektowanych starterów dla wybranych genów.

9. Analiza wyników reakcji qPCR. Eksploracyjna analiza danych transkryptomicznych - wprowadzenie.

10. Oznaczenia biochemiczne aktywności enzymów degradujących RNA. Analiza aktywności rybonukleolitycznych różnych wersji białka Dis3 - głównej podjednostki katalitycznej kompleksu egzosomu; badanie wrażliwości aktywności egzorybonukleolitycznej 5'-3' białka Xrn1 na status fosforylacji końca 5' substratu; reakcje degradacji syntetycznych oligonukleotydów RNA znakowanych fluorescencyjnie, rozdział produktów reakcji w denaturującym żelu poliakryloamidowym.

11. Eksploracyjna analiza danych transkryptomicznych i translatomicznych pochodzących z eksperymentów opartych na RNA-seq - ćwiczenia bioinformatyczne.

12. EMSA. Oddziaływania białka - kwasy nukleinowe. Wiązania drożdżowego białka Nsi1 z rDNA. Fluorescencyjny "gel-shift" (inkubacja prób, rozdział w natywnym żelu poliakrylamidowym, skan).

13. Prezentacje studentów na zaliczenie ćwiczeń.

Skrypt do zajęć oraz podręczniki „Genomy” T. Brown, „Genetyka molekularna” red. P. Węgleński, „Podstawy biologii molekularnej” L. A. Allison; literatura uzupełniająca: publikacje naukowe (doświadczalne i przeglądowe) wskazane w trakcie zajęć przez prowadzących; „Molecular Cloning: A Laboratory Manual” J. Sambrook i D. Russel 3-cia edycja lub 4-ta edycja M. R. Green and J. Sambrook.

Ma wiedzę na temat metabolizmu RNA u Eukariota.

Zna etapy ekspresji różnych klas RNA, ze szczególnym naciskiem na procesy współ- i po-transkrypcyjne, potrafi podać przykłady oddziaływań RNA - białko oraz zaangażowania cząsteczek RNA w procesy fizjologiczne.

Ma wiedzę dotyczącą enzymów modyfikujących RNA.

Posiada wiedzę teoretyczną i praktyczną pozwalającą na interpretowanie zjawisk i procesów związanych z metabolizmem RNA w oparciu o wyniki doświadczalne.

Samodzielnie planuje i przeprowadza podstawowe typy doświadczeń.

Zna słownictwo dot. metabolizmu RNA zarówno w jęz. polskim jak i angielskim, potrafi komunikować się i podejmować dyskusję na tematy związane z metabolizmem RNA.

Zna teoretyczne podstawy technik molekularnych wykorzystywanych do badania RNA, w stopniu pozwalającym na zrozumienie publikacji naukowych z tej dziedziny.

Potrafi krytycznie analizować otrzymane dane i je rzetelnie prezentować, co przyczynia się do podtrzymywania etosu zawodowego i rozwija zasady etyki zawodowej.

Językowe efekty uczenia się:

Wykorzystuje w sposób biegły naukowe i popularnonaukowe teksty biologiczne w języku ojczystym i angielskim oraz komunikuje się w języku angielskim na poziomie B2+ (K_U03 Bi2).

Posiada umiejętność przygotowania i wygłoszenia wystąpień ustnych w języku polskim i angielskim, zgodnie z wymaganiami określonymi dla poziomu B2+ (K_U11 Bi2).

Wykazuje umiejętność posługiwania się językiem nowożytnym (angielskim) w stopniu umożliwiającym korzystanie z literatury naukowej i komunikację z cudzoziemcami (K_U02 Bt2).

Warunki zaliczenia ćwiczeń:

- zajęcia zaliczone mogą być jedynie, jeśli student uczestniczył w nie mniej jak 85% zajęć,

- ćwiczenia zaliczane są na ocenę, na którą składają się punkty uzyskane za prezentacje przedstawiane przez studentów, dotyczące publikacji naukowych, w których stosowano techniki badania RNA (waga w końcowej ocenie - 2/3) oraz punkty uzyskane z prac domowych (waga w końcowej ocenie - 1/3),

- temat końcowej prezentacji student wybiera spośród propozycji prowadzących, ewentualnie student sam może zaproponować publikację ale wybór zawsze musi być zatwierdzony przez koordynatora,

- prezentacje w stylu otwartym, tzn. dopuszczamy pytania w trakcie prezentacji ze strony prowadzących jak i pozostałych uczestników kursu.

Warunki egzaminu końcowego z całego przedmiotu:

- przedmiot zaliczany jest na ocenę,

- do egzaminu może przystąpić jedynie student, który zaliczył ćwiczenia,

- egzamin testowy: test jednokrotnego wyboru (4 warianty odpowiedzi na każde pytanie),

- aby zaliczyć egzamin student musi uzyskać nie mniej niż 50% punktów.

Nie są wymagane.